關于實驗中抗體的常見問題及解決方法

邊緣效應

組織邊緣貼附不牢，邊緣組織松脫漂浮于液體中

APES/多聚賴氨酸處理玻片；組織切片盡量??；盡量避免選用壞死較多的組織

試劑未充分覆蓋組織

滴加試劑時讓試劑完整覆蓋組織

非特異性染色體

抗體質量問題

使用質量有保證的抗體

抗體孵育時間長

減少孵育時間

抗體濃度過高

降低抗體濃度

一抗為多抗

使用單克隆抗體

內源性過氧化物酶及biotin

延長滅活時間

封閉不足

延長封閉時間

DAB孵育時間過久或濃度過高

按說明書配置試劑，鏡下控制反應時間

抗體孵育后洗滌不充分

每次孵育之后洗3*5次

滴加試劑時干片

及時滴加試劑

切片在緩沖液中浸泡過久

抗原修復之后及時封閉加一抗，不能過夜

陰性結果

抗體濃度及質量

選擇有質量保證的抗體，先做預實驗摸索抗體使用濃度

抗原修復不全

摸索合適的抗原修復方式及修復時間

抗原豐度

正常陰性

封閉時間過長

減少封閉時間

DAB孵育時間短

鏡下控制顯色時間

細胞通透不全，抗體未能進入細胞反應

選擇合適的通透劑及其反應時間

一抗二抗不匹配

選擇正確來源的二抗

脫片

玻片未處理好

玻片清洗干凈后用APES或多聚賴氨酸處理

切片厚薄不均勻

更換刀片；調整好切片機狀態

烤片時間或溫度不夠

60攝食度2小時

組織自身問題

腫瘤壞死組織及骨組織本身易脫片

抗原修復時溫度迅速變化

抗原修復后讓其自然冷卻

操作時用力過猛

有脫片嫌疑的切片不要用力甩，用吸水紙吸干殘余液體

染色弱

抗體濃度低，孵育時間短

提高抗體濃度，延長反應時間

試劑使用超過有效期

試劑定時更新

滴加試劑時殘余緩沖液過多使試劑稀釋

滴加試劑前盡量減少殘余液體

封閉過度

減少封閉時間

著色不均勻

切片厚度不一致

更換刀片；調整好切片機狀態

試劑配制未混勻使局部濃度不一致

試劑充分混勻后滴加

試劑未完整覆蓋組織

滴加試劑時讓試劑完整覆蓋組織

脫蠟不完整

更換脫蠟劑或延長脫蠟時間